本发明公开一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌,其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GXA-28,保藏编号为CCTCCNO:M2012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心。该枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)GXA-28是在高温发酵生产γ-聚谷氨酸方面的应用,高温发酵的温度为40~50°C。本发明的枯草芽孢杆菌是从海沙中分离得到,可在较高温度下高效合成γ-聚谷氨酸,最高温度可为50°C,发酵时间18~25h,产量最高可达20~30g/l,生产速率可达0.9~1.3g/l?h,具有优良的温度特性、营养要求简单和培养方法简便易行等优点,这些优良特性为工业化生产提供了有利条件。
1.一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌,其特征在于:所述菌的分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28,保藏编号为CCTCCxa0NO:M2012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。
2.一种如权利要求1所述的用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的用途,其特征在于:所述枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28是在高温发酵生产γ-聚谷氨酸方面的应用,其高温发酵的温度为45~50°C。技术领域
本发明属于微生物领域,特别涉及到一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其用途。
背景技术
γ-聚谷氨酸(Poly(γ-glutamicxa0acid),γ-PGA)是由L-谷氨酸和D-谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基聚合而成的一种独特的生物高分子。通常是由500-5000个谷氨酸单体聚合而成,分子量在100-1000kDa之间。γ-聚谷氨酸分子中的谷氨酸残基上带有大量游离的亲水性羧基,可在分子内部或分子间形成氢键,具有极高的水溶性和吸水保湿性;这些游离羧基同时提供了阳离子结合的基团,使其对金属离子具有良好的吸附性。除此之外,γ-聚谷氨酸作为一种环境友好型生物高分子,还具有一些独特的优良特性,如可食用、可降解、生物兼容性、对人体和环境无毒害等。因此,其被作为冷冻保护剂、祛苦剂、增稠剂和矿物质吸附剂应用于食品领域;作为药物输送剂、基因载体、医用生物粘合剂应用于医药领域;作为热塑性材料、水凝胶等应用于工业和农业领域;作为金属吸附剂和生物絮凝剂应用于环保领域;作为保湿剂应用于化妆品领域。γ-聚谷氨酸于1937年由Ivánovics等人首先在炭疽芽胞杆菌荚膜中发现(Ivánovicsxa0andxa0Bruckner1937;Ivánovicsxa0andxa0Erdōs1937);并在1942年被证实可作为发酵产物由枯草芽孢杆菌分泌至液体培养基中(Bovamick1942)。由此,枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌被作为主要的γ-聚谷氨酸产生菌引起了广泛的研究。尤其是近十年来,国内外对微生物发酵生产γ-聚谷氨酸进行了广泛深入地研究。目前,日本和韩国已进行了工业化试生产。国内开展γ-聚谷氨酸的研究相对较晚,一些科研院校主要对γ-聚谷氨酸产生菌筛选、发酵工艺优化、分批发酵生产等进行了研究,取得了一些可喜的研究成果。γ-聚谷氨酸经过近二十年的研究和发展,菌种的发酵生产能力得到了较大幅度的提高,但是菌株发酵周期长、生产效率低、发酵工艺成本高等严重制约了γ-聚谷氨酸发酵工业化的进程。因此,寻找具有优良发酵特性的γ-聚谷氨酸产生菌具有重要的生产意义。海沙是由岩石经过风和水的侵蚀和冲刷形成的小颗粒,主要成分是二氧化硅。广西北海海沙因长期浸于高盐浓度的海水中,且广西北海地处亚热带地区,日照时间长,海沙长期处于高温日照条件下,因此从这种海沙样品中可分离到一些较其他材料来源发酵特性更加优良的菌种,如耐高盐、耐高温菌种。目前用于生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌,其分离菌种材料大多来源于土壤、豆腐乳、酱萝卜条、酱黄瓜、酱大蒜、豆酱、西瓜酱、酱菜、腊肠、豆鼓、纳豆、腊肉,关于以海沙为分离菌种材料,尚未有公开文献报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的不足,提供一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其用途,本发明的枯草芽孢杆菌是从海沙中分离得到,可在较高温度下高效合成γ-聚谷氨酸,最高温度可为50°C,发酵时间18~25h,产量最高可达20~30g/l,生产速率可达0.9~1.3g/l·h,具有优良的温度特性、营养要求简单和培养方法简便易行等优点,这些优良特性为工业化生产提供了有利条件。为了实现上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:一种用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌,其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28,保藏编号为CCTCCxa0NO:M2012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。以上所述枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28的培养方法包括如下步骤:(1)制备菌悬液:将海沙样品接入装有80~120ml无菌生理盐水的250ml三角瓶中,室温下磁力搅拌25~40分钟,制成菌悬液,于90~110°C处理8~15min;(2)菌悬液稀释、菌落挑取:将步骤(1)的菌悬液采用10倍稀释法梯度稀释成不同浓度的菌悬液,选择10⁵、10⁶和10⁷倍的菌悬液100μL涂布于固体分离培养基平板上,45~60°C恒温培养20~25h后,挑取菌落表面粘稠、用牙签能挑起拉丝的单菌落;(3)划线纯化:用平整、圆滑的接种环,在无菌操作条件下,挑取少量步骤(2)中的单菌落,在固体分离培养基平板上连续划线,将划线后的平板至于45~60°C恒温培养15~20h后,挑取平板上的纯种单菌落至试管斜面,经培养后保存;(4)传代培养:用平整、圆滑的接种环,在无菌操作条件下,挑取少量斜面保存的菌种转接至另一支新鲜试管斜面上,45~60°C恒温条件下,传代培养15~20h;(5)摇瓶检测发酵性能获取目标菌株:用平整、圆滑的接种环挑取斜面上长度为1~2cm的菌苔接入装有25~30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速160~250rpm,40~50°C培养10~15h至菌株对数生长中期,将种子液按1~10%接种量接入装有20~80ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中,摇床转速160~250rpm,40~50°C培养18~25h后,检测发酵液中γ-聚谷氨酸产量,选取产量最高者为目标菌株,即枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28。以上所述固体分离培养基的浓度组分如下:葡萄糖8~12g/l,酵母膏3~6g/l,谷氨酸和/或谷氨酸盐3~6g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1~0.2g/l,KH₂PO₄xa00.3~0.5g/l,琼脂10~15g/l,pH值6.5~7.5,蒸馏水配制。以上所述液体种子培养基的浓度组分如下:葡萄糖8~12g/l,酵母膏3~6g/l,谷氨酸和/或谷氨酸盐3~6g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1~0.2g/l,KH₂PO₄xa00.3~0.5g/l,pH值6.5~7.5,蒸馏水配制。以上所述液体发酵培养基浓度组分如下:葡萄糖20~50g/l,酵母膏2~5g/l,谷氨酸和/或谷氨酸盐15~30g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1~0.2g/l,KH₂PO₄xa00.3~0.5g/l,pH值6.5~7.5,蒸馏水配制。作为进一步限定,以上所述谷氨酸为L-谷氨酸。作为进一步限定,以上所述谷氨酸盐为谷氨酸钠和市售味精中的任意一种或几种混合物。如上所述的用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌的用途,是枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28在高温发酵生产γ-聚谷氨酸方面的应用,其高温发酵的温度为40~50°C。作为优选,以上所述高温发酵的温度为45~50°C。本发明枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28,以下称为CCTCCxa0NO:M2012347,其性状特征如下:(1)菌体形态特征:菌株CCTCCxa0NO:M2012347在固体斜面培养基上50°C培养16h后电镜观察,菌体呈杆状,大小0.7-0.9×2.0-3.0μm,可运动,革兰氏染色阳性。菌株CCTCCxa0NO:M2012347在固体斜面培养基上50°C培养30h后芽孢染色观察,可见明显芽孢。(2)菌落形态特征:菌株CCTCCxa0NO:M2012347在固体分离培养基平板上50°C培养24h后,在添加谷氨酸的平板上,菌落圆形、表面呈树突状、边缘分泌粘稠物、菌落直径达1.5-2.0cm;在不添加谷氨酸的平板上,菌落干燥、扁平、中央凹陷、边缘不规则。菌株CCTCCxa0NO:M2012347在液体分离培养基中培养,在液体表面可形成菌膜,培养液略显浑浊。(3)CCTCCxa0NO:M2012347生理生化性质如下表1所示。表1ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="547"/>注:所列表中的“+”为生长良好或呈阳性;“-”为不生长或呈阴性。(4)CCTCCxa0NO:M2012347的16Sxa0rDNA序列分析利用通用扩增引物1492r(5"-GGYxa0TACxa0CTTxa0GTTxa0ACGxa0ACTxa0T-3’,Y=Txa0orxa0C)和27f(5"-AGAxa0GTTxa0TGAxa0TCCxa0TGGxa0CTCxa0AG-3’)对该菌株16Sxa0rDNA进行扩增测序,测得序列长度1365bp。将所得序列提交至GenBank数据库,获得序列编号GenBankxa0ID:JN815234,与GenBank所提供的基因序列进行Blast比对分析,构建系统发育树。结果表明CCTCCxa0NO:M2012347与枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)同源性为99%。结合菌体、菌落形态特征、生理生化特征和16Sxa0rDNA序列分析,可以将菌株CCTCCxa0NO:M2012347分类鉴定为枯草芽孢杆菌,具体为枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28。本发明所述的固体斜面培养基的浓度组分为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸和/或谷氨酸盐5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH6.5~7.5,蒸馏水配制。与现有技术相比,本发明的有益效果是:1.本发明以海沙为分离材料,所制得的枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28,可在较高温度下高效合成γ-聚谷氨酸,最高温度可为50°C,发酵时间18~25h,产量最高可达20~30g/l,生产速率可达0.9~1.3g/l·h,具有优良的温度特性、营养要求简单和培养方法简便易行等优点,这些优良特性为工业化生产提供了有利条件。2.本发明枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28可广泛使用廉价的碳氮源,例如糖蜜、无机铵盐,其中可将无机铵盐作为唯一氮源使用,这些廉价原料可以满足工业化生产的要求。
附图说明
图1为γ-聚谷氨酸标准品的核磁共振(¹H-NMR)图;图2为本发明的产品γ-聚谷氨酸的核磁共振(¹H-NMR)图;图3为γ-聚谷氨酸标准品的红外谱图;图4为本发明的产品γ-聚谷氨酸的红外谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围,本发明枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28,以下称为CCTCCxa0NO:M2012347。实施例1:一、CCTCCxa0NO:M2012347的分离制备菌悬液:称取1g海沙样品接入装有100ml无菌生理盐水的250ml三角瓶中,室温下磁力搅拌30分钟,制成菌悬液,于100°C处理10min。菌悬液稀释、菌落挑取:将上述所得菌悬液采用10倍稀释法梯度稀释成不同浓度的菌悬液,选择10⁵,10⁶,10⁷倍的菌悬液100μl涂布于固体分离培养基平板上;50°C恒温培养24h后,挑取菌落表面粘稠、用牙签能挑起拉丝的单菌落。划线纯化:用平整、圆滑的接种环,在无菌操作条件下,将获得的单菌落在固体分离培养基平板上连续划线纯化,50°C恒温培养16h后,挑取平板上的纯种单菌落至试管斜面,经培养后保存。传代培养:用平整、圆滑的接种环,在无菌操作条件下,挑取少量斜面保存的纯化菌种转接至另一支新鲜试管斜面上,50°C恒温条件下,传代培养16h。摇瓶检测发酵性能:用平整、圆滑的接种环挑取斜面上长度为1cm的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养12h至菌株对数生长中期,将种子液按2%接种量接入装有50ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养22h后,检测发酵液中γ-聚谷氨酸产量,如下表2所示,选取产量最高者为目标菌株。其中,固体分离培养基的浓度组分如下:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,L-谷氨酸5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值6.5,蒸馏水配制;液体种子培养基的浓度组分如下:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,L-谷氨酸5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH值6.5,蒸馏水配制;液体发酵培养基浓度组分如下:葡萄糖30g/l,酵母膏2.5g/l,L-谷氨酸20g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH值6.5,蒸馏水配制。表2ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>二、CCTCCxa0NO:M2012347的鉴定(1)菌体形态特征:菌株CCTCCxa0NO:M2012347在固体斜面培养基上50°C培养16h后电镜观察,菌体呈杆状,大小0.7-0.9×2.0-3.0μm,可运动,革兰氏染色阳性。菌株CCTCCxa0NO:M2012347在固体斜面培养基上50°C培养30h后芽孢染色观察,可见明显芽孢。(2)菌落形态特征:菌株CCTCCxa0NO:M2012347在固体分离培养基平板上50°C培养24h后,在添加谷氨酸的平板上,菌落圆形、表面呈树突状、边缘分泌粘稠物、菌落直径达1.5-2.0cm;在不添加谷氨酸的平板上,菌落干燥、扁平、中央凹陷、边缘不规则。菌株CCTCCxa0NO:M2012347在液体分离培养基中培养,在液体表面可形成菌膜,培养液略显浑浊。(3)CCTCCxa0NO:M2012347生理生化性质如下表3所示。表3ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="616"/>注:所列表中的“+”为生长良好或呈阳性;“-”为不生长或呈阴性。(4)CCTCCxa0NO:M2012347的16Sxa0rDNA序列分析利用通用扩增引物1492r(5"-GGYxa0TACxa0CTTxa0GTTxa0ACGxa0ACTxa0T-3’,Y=Txa0orxa0C)和27f(5"-AGAxa0GTTxa0TGAxa0TCCxa0TGGxa0CTCxa0AG-3’)对该菌株16Sxa0rDNA进行扩增测序,测得序列长度1365bp。将所得序列提交至GenBank数据库,获得序列编号GenBankxa0ID:JN815234,与GenBank所提供的基因序列进行Blast比对分析,构建系统发育树。结果表明CCTCCxa0NO:M2012347与枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)同源性为99%。目标菌株经菌体、菌落形态特征,生理生化特征和16Sxa0rDNA序列分析确定该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28,将枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28送至中国典型培养物保藏中心进行保藏,其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28,保藏编号为CCTCCxa0NO:M2012347,保藏日期为2012年9月14日,保藏单位:中国典型培养物保藏中心,保藏地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学。以下为本发明所述菌株枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)GXA-28,CCTCCxa0M2012347的16Sxa0rDNA核苷酸序列信息:16Sxa0rDNA,序列长度1365bp,GenBankxa0ID:JN815234gcttgctcccxa0tgatgttagcxa0ggcggacgggxa0tgagtaacacxa0gtgggtaaccxa0tgcctgtaagxa0xa0xa0xa0xa060actgggataaxa0ctccgggaaaxa0ccggggctaaxa0taccggatggxa0ttgtttgaacxa0cgcatggttcxa0xa0xa0xa0120aaacataaaaxa0ggtggcttcgxa0gctaccacttxa0acagatggacxa0ccgcggcgcaxa0ttagctagttxa0xa0xa0xa0180ggtgaggtaaxa0cggctcaccaxa0aggcaacgatxa0gcgtagccgaxa0cctgagagggxa0tgatcggccaxa0xa0xa0xa0240cactgggactxa0gagacacggcxa0ccagactcctxa0acgggaggcaxa0gcagtagggaxa0atcttccgcaxa0xa0xa0xa0300atggacgaaaxa0gtctgacggaxa0gcaacgccgcxa0gtgagtgatgxa0aaggttttcgxa0gatcgtaaagxa0xa0xa0xa0360ctctgttgttxa0agggaagaacxa0aagtaccgttxa0cgaatagggcxa0ggtaccttgaxa0cggtacctaaxa0xa0xa0xa0420ccagaaagccxa0acggctaactxa0acgtgccagcxa0agccgcggtaxa0atacgtaggtxa0ggcaagcgttxa0xa0xa0xa0480gtccggaattxa0attgggcgtaxa0aagggctcgcxa0aggcggtttcxa0ttaagtctgaxa0tgtgaaagccxa0xa0xa0xa0540cccggctcaaxa0ccggggagggxa0tcattggaaaxa0ctggggaactxa0tgagtgcagaxa0agaggagagtxa0xa0xa0xa0600ggaattccacxa0gtgtagcggtxa0gaaatgcgtaxa0gagatgtggaxa0ggaacaccagxa0tggcgaaggcxa0xa0xa0xa0660gactctctggxa0tctgtaactgxa0acgctgaggaxa0gcgaaagcgtxa0ggggagcgaaxa0caggattagaxa0xa0xa0xa0720taccctggtaxa0gtccacgccgxa0taaacgatgaxa0gtgctaagtgxa0ttagggggttxa0tccgccccttxa0xa0xa0xa0780agtgctgcagxa0ctaacgcattxa0aagcactccgxa0cctggggagtxa0acggtcgcaaxa0gactgaaactxa0xa0xa0xa0840caaaggaattxa0gacgggggccxa0cgcacaagcgxa0gtggagcatgxa0tggtttaattxa0cgaagcaacgxa0xa0xa0xa0900cgaagaacctxa0taccaggtctxa0tgacatcctcxa0tgacaatcctxa0agagataggaxa0cgtccccttcxa0xa0xa0xa0960gggggcagagxa0tgacaggtggxa0tgcatggttgxa0tcgtcagctcxa0gtgtcgtgagxa0atgttgggttxa0xa0xa01020aagtcccgcaxa0acgagcgcaaxa0cccttgatctxa0tagttgccagxa0cattcagttgxa0ggcactctaaxa0xa0xa01080ggtgactgccxa0ggtgacaaacxa0cggaggaaggxa0tggggatgacxa0gtcaaatcatxa0catgccccttxa0xa0xa01140atgacctgggxa0ctacacacgtxa0gctacaatggxa0acagaacaaaxa0gggcagcgaaxa0accgcgaggtxa0xa0xa01200taagccaatcxa0ccacaaatctxa0gttctcagttxa0cggatcgcagxa0tctgcaactcxa0gactgcgtgaxa0xa0xa01260agctggaatcxa0gctagtaatcxa0gcggatcagcxa0atgccgcggtxa0gaatacgttcxa0ccgggccttgxa0xa0xa01320tacacaccgcxa0ccgtcacaccxa0acgagagtttxa0gtaacacccgxa0aagtcxa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa0xa01365实施例2:一、CCTCCxa0NO:M2012347的分离制备菌悬液:称取1g海沙样品接入装有80ml无菌生理盐水的250ml三角瓶中,室温下磁力搅拌25分钟,制成菌悬液,于90°C处理15min。菌悬液稀释、菌落挑取:将上述所得菌悬液采用10倍稀释法梯度稀释成不同浓度的菌悬液,选择10⁵,10⁶,10⁷倍的菌悬液100μl涂布于固体分离培养基平板上;45°C恒温培养20h后,挑取菌落表面粘稠、用牙签能挑起拉丝的单菌落。划线纯化:用平整、圆滑的接种环,在无菌操作条件下,将获得的单菌落在固体分离培养基平板上连续划线纯化,45°C恒温培养15h后,挑取平板上的纯种单菌落至试管斜面,经培养后保存。传代培养:用平整、圆滑的接种环,在无菌操作条件下,挑取少量斜面保存的纯化菌种转接至另一支新鲜试管斜面上,45°C恒温条件下,传代培养15h。摇瓶检测发酵性能:用平整、圆滑的接种环挑取斜面上长度为1.5cm的菌苔接入装有25ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速160rpm,40°C培养10h至菌株对数生长中期,将种子液按1%接种量接入装有20ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中,摇床转速160rpm,40°C培养18h后,检测发酵液中γ-聚谷氨酸产量,如下表4所示,选取产量最高者为目标菌株。其中,固体分离培养基的浓度组分如下:葡萄糖8g/l,酵母膏3g/l,谷氨酸钠3g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.3g/l,琼脂10g/l,pH值7.0;液体种子培养基的浓度组分如下:葡萄糖8g/l,酵母膏3g/l,谷氨酸钠3g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.3g/l,pH值7.0;液体发酵培养基浓度组分如下:葡萄糖20g/l,酵母膏2g/l,谷氨酸钠15g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.3g/l,pH值7.0,蒸馏水配制。其余步骤与实施例1相同。表4ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例3:一、CCTCCxa0NO:M2012347的分离制备菌悬液:称取1g海沙样品接入装有120ml无菌生理盐水的250ml三角瓶中,室温下磁力搅拌40分钟,制成菌悬液,于110°C处理8min。菌悬液稀释、菌落挑取:将上述所得菌悬液采用10倍稀释法梯度稀释成不同浓度的菌悬液,选择10⁵,10⁶,10⁷倍的菌悬液100μl涂布于固体分离培养基平板上;60°C恒温培养25h后,挑取菌落表面粘稠、用牙签能挑起拉丝的单菌落。划线纯化:用平整、圆滑的接种环,在无菌操作条件下,将获得的单菌落在固体分离培养基平板上连续划线纯化,60°C恒温培养25h后,挑取平板上的纯种单菌落至试管斜面,经培养后保存。传代培养:用平整、圆滑的接种环,在无菌操作条件下,挑取少量斜面保存的纯化菌种转接至另一支新鲜试管斜面上,60°C恒温条件下,传代培养20h。摇瓶检测发酵性能:用平整、圆滑的接种环挑取斜面上长度为2cm的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速250rpm,50°C培养15h至菌株对数生长中期,将种子液按10%接种量接入装有80ml液体发酵培养基的250ml三角瓶中,摇床转速250rpm,50°C培养25h后,检测发酵液中γ-聚谷氨酸产量,如下表5所示,选取产量最高者为目标菌株。其中,固体分离培养基的浓度组分如下:葡萄糖12g/l,酵母膏6g/l,味精6g/l,MgSO₄·7H₂O0.2g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值7.5;液体种子培养基的浓度组分如下:葡萄糖12g/l,酵母膏6g/l,味精6g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH值7.5;液体发酵培养基浓度组分如下:葡萄糖50g/l,酵母膏5g/l,味精30g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH值7.0,蒸馏水配制。其余步骤与实施例1相同。表5ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例4:与实施例1不同之处在于:固体分离培养基的浓度组分如下:葡萄糖10g/l,酵母膏4g/l,谷氨酸钠和味精4g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa00.4g/l,琼脂12g/l,pH值7.0;液体种子培养基的浓度组分如下:葡萄糖10g/l,酵母膏4g/l,谷氨酸钠和味精4g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa00.4g/l,pH值7.0;液体发酵培养基浓度组分如下:葡萄糖40g/l,酵母膏4g/l,谷氨酸钠和味精25g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.4g/l,pH值7.0,蒸馏水配制。其余步骤与实施例1相同。检测发酵液中γ-聚谷氨酸产量,如下表6所示。表6ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例5:与实施例2不同之处在于:固体分离培养基的浓度组分如下:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,L-谷氨酸和谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值6.5;液体种子培养基的浓度组分如下:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,L-谷氨酸和谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂O0.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH值6.5,蒸馏水配制;液体发酵培养基浓度组分如下:葡萄糖30g/l,酵母膏2.5g/l,L-谷氨酸和谷氨酸钠20g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH值6.5,蒸馏水配制。其余步骤与实施例2相同。检测发酵液中γ-聚谷氨酸产量,如下表7所示。表7ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例6:与实施例3不同之处在于:固体分离培养基的浓度组分如下:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,L-谷氨酸、谷氨酸钠和味精5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值6.5;液体种子培养基的浓度组分如下:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,L-谷氨酸、谷氨酸钠和味精5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH值6.5,蒸馏水配制;液体发酵培养基浓度组分如下:葡萄糖30g/l,酵母膏2.5g/l,L-谷氨酸、谷氨酸钠和味精20g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄0.5g/l,pH值6.5,蒸馏水配制。其余步骤与实施例3相同。检测发酵液中γ-聚谷氨酸产量,如下表8所示。表8ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>将实施例1~6所培养的CCTCCxa0NO:M2012347用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸。应用实施例一至五:(1)菌种活化、保藏:将CCTCCxa0NO:M2012347接于固体斜面培养基上,45°C培养16h,于4°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值7.0,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养12h至菌株对数生长中期;液体种子培养基浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH值7.0,蒸馏水配制;(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量2%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,45°C培养22h;其中所述液体发酵培养基浓度组分为:碳源30g/l,酵母膏2.5g/l,谷氨酸钠30g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa01g/l,pH值7.0,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入4倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%,加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。其中所述碳源为葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和糖蜜,按上述方法经摇瓶发酵后,分析所得发酵液中γ-聚谷氨酸含量如下表9所示。表9ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>应用实施例六至十二:(1)菌种活化、保藏:将CCTCCxa0NO:M2012347接于固体斜面培养基上,45°C培养16h,于4°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值7.0,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌株接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养12h至菌株对数生长中期;液体种子培养基浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH值7.0,蒸馏水配制;(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量2%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,45°C培养22h;其中液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖30g/l,氮源2.5g/l,谷氨酸钠30g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa01g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入4倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%,加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。其中所述氮源为酵母膏、玉米浆、尿素、NaNO₃、NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄、酵母膏+NH₄Cl(质量比1:4),按上述方法经摇瓶发酵后,分析所得发酵液中γ-聚谷氨酸含量如下表10所示。表10ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>应用实施例十三(1)菌种活化:将CCTCCxa0M2012347接于固体斜面培养基上,45°C培养16h,于4°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂O0.1g/l,KH₂PO₄0.5g/l,琼脂15g/l,pH值6.5,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养12h至菌株对数生长中期;其中所述液体种子培养基浓度组分为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量2%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,50°C培养22h;其中液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖30g/l,酵母膏2.5g/l,谷氨酸钠20g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入4倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%,加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为17.3±1.1g/l。应用实施例十四:(1)菌种活化:将CCTCCxa0M2012347接于固体斜面培养基上,45°C培养16h,于4°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值7.5,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养12h至菌株对数生长中期;其中所述液体种子培养基浓度组分为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量2%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,45°C培养22h;其中液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖30g/l,酵母膏2.5g/l,谷氨酸钠20g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入4倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%,加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为19.9±1.3g/l。应用实施例十五:(1)菌种活化:将CCTCCxa0M2012347接于固体斜面培养基上,45°C培养16h,于4°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,琼脂15g/l,pH值7.0,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速180rpm,45°C培养12h至菌株对数生长中期;其中所述液体种子培养基浓度组分为:葡萄糖10g/l,酵母膏5g/l,谷氨酸钠5g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.5g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量5%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,45°C培养22h;其中所述液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖40g/l,酵母膏2.5g/l,谷氨酸钠40g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa01g/l,pH7.0,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入4倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.45μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为100KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的30%,加入3倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为33.6±1.5g/l。应用实施例十六:与实施例15的不同之处在于:(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量5%(v/v),摇瓶装液量50ml/250ml,摇床转速180rpm,42°C培养22h;取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为28.9±1.3g/l。其余步骤与实施例15相同。应用实施例十七:(1)菌种活化:将CCTCCxa0Mxa02012347接于固体斜面培养基上,40°C培养8h,于2°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖8g/l,酵母膏3g/l,谷氨酸钠3g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa00.3g/l,琼脂10g/l,pH值6.5,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速160rpm,40°C培养24h至菌株对数生长中期;其中所述液体种子培养基浓度组分为:葡萄糖20g/l,酵母膏10g/l,谷氨酸钠10g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa01g/l,pH6.5,蒸馏水配制。(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量8%(v/v),摇瓶装液量20ml/250ml,摇床转速160rpm,40°C培养25h;其中液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖10g/l,酵母膏2g/l,谷氨酸钠10g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.2g/l,KH₂PO₄xa02g/l,pH6.5,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入3倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.22μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为50KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的40%,加入2倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为8.5±0.7g/l。应用实施例十八:(1)菌种活化:将CCTCCxa0M2012347接于固体斜面培养基上,50°C培养10h,于8°C作短期保藏;固体斜面培养基的浓度组成为:葡萄糖12g/l,酵母膏6g/l,谷氨酸钠6g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.1g/l,KH₂PO₄xa00.4g/l,琼脂12g/l,pH值7.5,蒸馏水配制;(2)种子液制备:将上述斜面上1.0cm²的菌苔接入装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,摇床转速250rpm,50°C培养18h至菌株对数生长中期;其中所述液体种子培养基浓度组分为:葡萄糖50g/l,酵母膏2g/l,谷氨酸钠20g/l,MgSO₄·7H₂Oxa00.5g/l,KH₂PO₄xa02g/l,pH7.5,蒸馏水配制。(3)液体摇瓶发酵:将种子液接入灭菌后的液体发酵培养基中,接种量10%(v/v),摇瓶装液量80ml/250ml,摇床转速250rpm,50°C培养18h;其中液体发酵培养基浓度组分为:葡萄糖100g/l,酵母膏20g/l,谷氨酸钠100g/l,MgSO₄·7H₂Oxa01g/l,KH₂PO₄xa05g/l,pH7.5,蒸馏水配制。(4)γ-聚谷氨酸提取纯化:收集成熟的发酵液,加入5倍体积蒸馏水稀释,利用孔径为0.40μm微滤膜去除菌体,上清液采用截留分子量为80KDa超滤膜浓缩至原发酵液体积的50%,加入4倍体积的工业级乙醇进行沉淀,收集沉淀,冷冻干燥得到γ-聚谷氨酸成品。取适量成品准确称取其重量,换算成发酵液中γ-聚谷氨酸含量为30.6±1.2g/l。本发明应用实施例所获得的γ-聚谷氨酸产品理化性质表征如下:(1)产品易溶于水,不溶于甲醇、乙醇或丙酮等有机溶剂;(2)产品茚三酮显色反应呈阴性,盐酸水解产物茚三酮反应呈阳性;盐酸完全水解产物经薄层层析分析,氨基酸组分只有谷氨酸;上述说明本产品为谷氨酸的均聚物;(3)产品在216nm下具有特征吸收峰,在280nm下无吸收峰;缩二脲显色反应呈阴性;上述说明本产品没有典型的肽链结构;(4)产品经核磁共振(¹H-NMR)和红外光谱检测,图谱结果显示与γ-聚谷氨酸标准品结构相符。核苷酸序列表<110>广西南宁智天生物科技有限公司<120>用于高温发酵生产γ-聚谷氨酸的枯草芽孢杆菌及其用途<160>1<170>PatentInxa0version3.5<210>1<211>1365<212>DNA<213>枯草芽孢杆菌(Bacillusxa0subtilis)<400>1gcttgctcccxa0tgatgttagcxa0ggcggacgggxa0tgagtaacacxa0gtgggtaaccxa0tgcctgtaagxa0xa0xa0xa0xa060actgggataaxa0ctccgggaaaxa0ccggggctaaxa0taccggatggxa0ttgtttgaacxa0cgcatggttcxa0xa0xa0xa0120aaacataaaaxa0ggtggcttcgxa0gctaccacttxa0acagatggacxa0ccgcggcgcaxa0ttagctagttxa0xa0xa0xa0180ggtgaggtaaxa0cggctcaccaxa0aggcaacgatxa0gcgtagccgaxa0cctgagagggxa0tgatcggccaxa0xa0xa0xa0240cactgggactxa0gagacacggcxa0ccagactcctxa0acgggaggcaxa0gcagtagggaxa0atcttccgcaxa0xa0xa0xa0300atggacgaaaxa0gtctgacggaxa0gcaacgccgcxa0gtgagtgatgxa0aaggttttcgxa0gatcgtaaagxa0xa0xa0xa0360ctctgttgttxa0agggaagaacxa0aagtaccgttxa0cgaatagggcxa0ggtaccttgaxa0cggtacctaaxa0xa0xa0xa0420ccagaaagccxa0acggctaactxa0acgtgccagcxa0agccgcggtaxa0atacgtaggtxa0ggcaagcgttxa0xa0xa0xa0480gtccggaattxa0attgggcgtaxa0aagggctcgcxa0aggcggtttcxa0ttaagtctgaxa0tgtgaaagccxa0xa0xa0xa0540cccggctcaaxa0ccggggagggxa0tcattggaaaxa0ctggggaactxa0tgagtgcagaxa0agaggagagtxa0xa0xa0xa0600ggaattccacxa0gtgtagcggtxa0gaaatgcgtaxa0gagatgtggaxa0ggaacaccagxa0tggcgaaggcxa0xa0xa0xa0660gactctctggxa0tctgtaactgxa0acgctgaggaxa0gcgaaagcgtxa0ggggagcgaaxa0caggattagaxa0xa0xa0xa0720taccctggtaxa0gtccacgccgxa0taaacgatgaxa0gtgctaagtgxa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